Aug 04, 2023
거대고리 펩타이드를 단편 결정성 영역에 접목하여 향상된 약동학을 갖춘 수용체 작용제 설계
자연의생명공학과
Nature Biomedical Engineering 7권, 164~176페이지(2023)이 기사 인용
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순환계의 반감기가 짧고 혈액-뇌 장벽을 통과하는 수송이 원활하지 않아 수용체 작용제 역할을 하는 사이토카인과 성장 인자의 유용성이 제한됩니다. 여기에서 우리는 인간 면역글로불린의 결정화 가능한(Fc) 단편 영역의 구조 루프에 거대고리 펩타이드 약리단을 유전적으로 삽입함으로써 순환에서 더 긴 반감기와 혈액-뇌 장벽을 통한 향상된 수송 속도를 갖는 대용 수용체 작용제가 생성될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 Fc 영역의 발현 수준과 신생아 Fc 수용체에 대한 친화력을 보존하는 이러한 '올가미 이식' 접근법을 사용하여 수용체 티로신 단백질 키나제 Met에 결합하는 거대고리 펩타이드를 갖는 Fc 기반 단백질 지지체를 생성했습니다. Met 작용제는 Met를 이량체화하여 천연 리간드에 의해 유도된 것과 유사한 생물학적 반응을 유도합니다. 더욱이, Met 결합 거대고리 펩타이드를 갖는 마우스 항-트랜스페린-수용체 항체의 Fc 영역의 올가미 이식은 마우스의 뇌 실질에서 생성된 Met 작용제의 축적을 강화시켰다. 올가미 접목을 통해 안정성과 약동학이 강화된 디자이너 단백질 치료법이 가능해질 수 있습니다.
치료제로서 사이토카인과 성장 인자의 임상적 사용은 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며1,2, 신경 발생 및 뇌 복구3,4와 같은 신흥 분야에서의 잠재적인 적용은 집중적인 연구 주제입니다. 그러나 고유한 구조적 특성으로 인해 향상된 물리화학적 안정성 및 약동학, 특히 더 나은 반감기 또는 혈액뇌장벽(BBB) 침투를 위해 엔지니어링하기가 어렵습니다. 단백질 치료제의 약동학을 제어하는 기존 방법에는 폴리(에틸렌 글리콜) 접합 및 면역글로불린의 단편 결정화 가능(Fc) 영역과의 융합5,6,7이 포함되어 반감기를 연장합니다. 및 항-트랜스페린 수용체(TfR) 항체의 Fab와 융합하여 BBB를 통한 침투를 강화합니다8,9,10. 그러나 이러한 방법이 생체 활성에 부정적인 영향을 주지 않고 단백질의 약동학을 향상시킬 수 있는 정도는 각 단백질의 특성에 따라 달라집니다5,6,7,8. 사이토카인과 성장 인자의 고유한 구조적 한계를 극복하기 위해 천연 리간드11,12와 구조적으로 관련이 없는 대리 작용제의 개발이 진행되었습니다. 이러한 최근의 발전에도 불구하고 원하는 물리화학적 안정성과 약동학을 갖춘 단백질 치료제를 설계하기 위한 보다 강력하고 다양한 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 남아 있습니다.
거대고리 펩타이드는 항체와 같은 결합 친화성 및 특이성13,14, 고유한 화학적 공간을 표적으로 삼는 능력15,16,17,18 및 합리적인 발견을 통한 효율적인 발견과 같은 여러 가지 바람직한 특징을 자랑하는 유망한 신규 클래스의 약물 후보로 부상했습니다. /계산 설계 및 시험관 내 디스플레이18,19,20,21. 일반적으로 거대고리 펩타이드는 제한된 고리 구조로 인해 선형 펩타이드보다 표적에 대해 더 큰 친화성을 나타냅니다. 이러한 거대고리 펩타이드의 적용 가능성을 확장하는 흥미로운 가능성은 이를 단백질 지지체에 '접목'하여 펩타이드와 단백질의 기능적 조합을 가능하게 하는 것입니다. 그러나 새로 확인된 펩타이드를 단백질 루프에 접목하는 것은 접목된 펩타이드와 숙주 단백질 둘 다의 잠재적인 잘못 접힘으로 인해 어려운 일이었습니다.
메신저 RNA 디스플레이와 유전자 코드 재프로그래밍을 통합한 RaPID(무작위 비표준 펩타이드 통합 발견) 시스템의 개발을 통해 표적 단백질에 대한 절묘한 결합 특이성을 갖는 티오에테르 기반 고리화된 거대고리 펩타이드의 발견이 가능해졌습니다. 이전 연구에서 우리는 RaPID 유래 약리단 서열이 표면에 노출된 단백질 루프에 쉽게 이식될 수 있으며 게스트 펩타이드와 호스트 단백질의 기능을 모두 유지할 수 있음을 보여주었습니다. 이를 '올가미 이식'이라고 합니다. . 관찰된 예외적인 접목 호환성은 아마도 스캐폴드 단백질의 관련 없는 루프 구조의 맥락에서도 부모 거대고리와 유사한 표적 결합 형태로 자가 접히는 약리단 모티프의 본질적인 특성 때문일 것입니다.
B1 > B2, which correlated well with their ability to activate cellular Met. The BS3-crosslinked 2:1 complex of MetECD and Fc(aMD4)B3 was purified by size exclusion chromatography (Extended Data Fig. 5c) and subjected to single-molecule examination by high-speed atomic force microscopy (HS-AFM)42, with Fc and MetECD as controls (Fig. 3c–f and Supplementary Videos 1–4). On HS-AFM, MetECD showed a globular Sema domain and Ig-like, plexins, transcription factors (IPT) stalk domains, with the relative positioning of each IPT domain being flexible (Fig. 3d and Supplementary Video 2). Fc(aMD4)B3 bound to the lower face of the Sema domain and bridged two Met molecules while having the IPT stalk domains sprayed away (Fig. 3e and Supplementary Video 3) or attached (Fig. 3f and Supplementary Video 4). The flexibility of IPT domains probably allows for the proper association of the intracellular kinase domains of two Met molecules, this association being essential for Met activation33,34. These results show that while Fc(aMD4)B3 binds to Met on a site different from that in HGF, its recruitment of two Met receptors in close proximity enables it to activate Met to the same extent as HGF./p>12 weeks, 19–24 g) given a single tail-vein injection or subcutaneous injection at 5.0 mg kg−1 for Fc(aMD4)B3, diluted in 100 µl PBS. Blood was drawn from the submandibular vein using a Goldenrod animal lancet (Bio Research Center) or from the orbital plexus at each time point, processed to serum and stored at −80 °C until analysis. The serum concentrations of Fc and Fc(aMD4)B3 were determined using a human immunoglobulin recognition immunoassay (human IgG ELISA quantitation set, Bethyl Laboratories). The serum concentrations of HGF were determined using an in-house developed ELISA. All animal experimental procedures were conducted in accordance with the guidelines provided by the Proper Conduct of Animal Experiments (1 June 2006, Science Council of Japan). The procedures were approved by the Institutional Review Board of Kanazawa University or the Laboratory Animal Ethics Committee of PhoenixBio./p>12 weeks, 15–21 g) were given a single subcutaneous injection at 5 mg kg−1 for Fc(aMD4)B3 in 200 µl PBS or control PBS. Forty-four hours after administration of Fc(aMD4)B3 or control PBS, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) (Sigma Chemical) was intraperitoneally injected into chimeric mice at a dose of 100 mg kg−1 for 2 h before killing. Livers isolated from PXB-mice were treated with RNAlater for RNA-seq or prepared for BrdU staining. Formalin-fixed paraffin sections of chimeric livers were incubated with a rat anti-BrdU antibody at 3 µg ml−1 (Abcam, ab6326), followed by an Alexa Fluor 488-conjugated anti-rat IgG goat polyclonal antibody at 1 µg ml−1 (Abcam, ab150157). Nuclei were counterstained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Fisher) at 300 nM. Fluorescent images were obtained using Keyence BZ-X810. The number of BrdU-positive nuclei was determined by counting at least 15,000 cells in 20 randomly selected visual fields in sections from the lateral left lobe and medial right lobe per animal. The procedures involving humanized liver tissues were approved by the Utilization of Human Tissue Ethical Committee of PhoenixBio. All animal experimental procedures were conducted in accordance with the guidelines provided by the Proper Conduct of Animal Experiments (1 June 2006, Science Council of Japan). The procedures were approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of PhoenixBio./p>
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