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Jan 02, 2024

세포 배양에서 발현을 위한 원형 DNA의 효율적인 변형 및 준비

커뮤니케이션 생물학 볼륨

커뮤니케이션 생물학 5권, 기사 번호: 1393(2022) 이 기사 인용

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DNA 플라스미드는 세포 배양 실험에서 RNA와 단백질을 전달하고 발현하는 데 필수적인 도구입니다. 플라스미드 준비에는 일반적으로 박테리아 복제, 검증 및 정제라는 힘든 과정이 포함됩니다. 발현 플라스미드를 설계하고 계약 제조업체에 주문할 수 있지만, 많은 수의 플라스미드가 필요한 경우 비용이 엄청날 수 있습니다. 우리는 형질감염 준비가 된 발현 요소를 포함하는 원형 DNA를 단 3시간 만에 생산하여 박테리아 클로닝 단계를 제거할 수 있는 효율적인 완전 합성 방법과 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 선형 이중 가닥 DNA 단편을 가져와 최소한의 실습 시간으로 이 DNA 단편을 효율적으로 원형화하고 정제하는 방법을 설명합니다. 원리의 증거로 우리는 조작된 프라임 편집 가이드 RNA(epegRNA)를 발현하는 원형 벡터를 세포 배양에 적용했으며, 플라스미드로 발현된 가이드와 비교하여 이 방법의 성능과 일치하거나 심지어 초과하는 성능을 입증했습니다. 이 방법의 준비 속도, 저렴한 비용 및 사용 용이성은 짧은 RNA 및 단백질의 발현이 필요한 응용 분야에서 유용한 도구가 될 것입니다.

세포 배양에서 일시적인 발현을 위한 RNA 및 단백질의 준비 및 전달을 위한 많은 기술이 존재합니다1. 본 연구에서는 새롭고 효율적인 준비 방법을 제시합니다. 데모로서 우리는 유전자 편집 응용 분야에서 우리 방법의 사용을 설명할 것입니다. 그러나 이 방법의 기본 원리는 일반적이기 때문에 이 방법은 RNA와 단백질의 발현이 필요한 다양한 목적과 응용 분야에 유용할 수 있습니다. 우리는 유전자 편집을 위한 구체적인 구현에 대해 논의하고 우리 방법을 기존 준비 기술과 비교할 것이지만, 이 논문의 목표는 실험실 환경에서 발현 벡터를 준비하는 새로운 접근 방식을 제시하는 것입니다. 그런.

세포에 전달될 때 유전자 편집을 촉진하는 세 가지 가장 일반적인 접근법은 다음과 같습니다: (I) Cas9 및 기타 보충 단백질을 코딩하는 단일 또는 다중 플라스미드2 및 전통적인 CRISPR/Cas9, 염기 편집, 프라임 편집 또는 기타 방법에 적합한 가이드 RNA의 구현3,4 ,5,6; (II) Cas9 mRNA 및 가이드 RNA7; (III) 가이드 RNA8과 복합체를 형성한 Cas9 단백질. 앞서 언급한 유전자 편집 구성체의 다양한 전달 방법이 현재 사용되고 있습니다. 전달 방법의 선택은 전기천공9,10, 리포펙션11, 직접적인 물리적 형질감염12, 폴리머 입자 및 마이크로캐리어13에 대한 벡터 전달 및 앞서 언급한 방법의 양식을 포함할 수 있는 특정 요구 사항과 연구자의 선호도에 따라 달라집니다.

접근 방식 (I), 일시적 발현을 위해 플라스미드 형질감염을 사용한 유전자 편집은 개념적 단순성, 취급 용이성 및 플라스미드의 안정성으로 인해 일반적으로 사용됩니다. 그러나 플라스미드 준비는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 과정으로 일반적으로 2일이 소요됩니다2(보충 참고 1의 일반적인 박테리아 복제 단계 참조).

우리는 3시간 만에 형질감염 준비가 된 발현 요소를 포함하는 원형 DNA를 생산할 수 있는 효율적인 완전 합성 방법과 프로토콜을 개발하여 박테리아 복제 단계를 제거했습니다. 원형화된 DNA는 세포질14에서 엑소뉴클레아제 분해에 저항성이 있습니다. 선형 DNA에는 이러한 안정성이 부족하며 이는 유전자 전달에 이를 활용하는 데 중요한 장벽이 됩니다. 더욱이, 우리의 방법은 엑소뉴클레아제를 사용하여 반응하지 않거나 잘못 반응한 선형 DNA 단편을 소화함으로써 원형 DNA를 정제함으로써 이러한 특성의 차이를 활용합니다.

우리는 발현 벡터 길이의 실제 범위가 450~950bp 사이이며 입력 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 원형 발현 벡터로 변환하는 효율이 최대 62%에 도달한다는 것을 확인했습니다. 이 방법은 다소 긴 조각에 대해 더 낮은 효율성으로 사용될 수도 있습니다. 간결함과 일관성을 유지하고 본 문서의 준비 단계 및 최종 제품에 대한 설명과의 혼동을 피하기 위해 이 원형 DNA 발현 벡터 구성 및 방법을 대문자로 이탤릭체로 표시한 원형 벡터로 지칭합니다.