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Aug 05, 2023

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Nature Communications 14권, 기사 번호: 1770(2023) 이 기사 인용

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박테리아 또는 효모 디스플레이 시스템의 방향성 진화는 구조적 및 생물물리학적 연구를 위한 G 단백질 결합 수용체의 안정성과 발현을 향상시키는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 복잡한 분자 구성이나 불리한 리간드 특성으로 인해 미생물 시스템에서 여러 수용체를 다룰 수 없습니다. 여기에서는 포유류 세포에서 G 단백질 결합 수용체를 진화시키는 접근법을 보고합니다. 클론성과 균일한 발현을 달성하기 위해 우리는 Vaccinia 바이러스를 기반으로 하는 바이러스 형질도입 시스템을 개발합니다. 합성 DNA 라이브러리의 합리적인 설계를 통해 우리는 먼저 높은 안정성과 발현을 위해 뉴로텐신 수용체 1을 진화시켰습니다. 둘째, 우리는 부갑상선 호르몬 1 수용체와 같은 복잡한 분자 구조와 큰 리간드를 가진 수용체가 쉽게 진화될 수 있음을 입증합니다. 중요한 것은 기능적 수용체 특성이 이제 포유동물의 신호 전달 환경에서 진화하여 리간드 결합 부위와 G 단백질 인터페이스 사이의 알로스테릭 결합이 증가된 수용체 변이체를 생성할 수 있다는 점입니다. 따라서 우리의 접근 방식은 GPCR 활성화에 필요한 복잡한 분자 상호 작용에 대한 통찰력을 제공합니다.

G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 내재막 단백질의 가장 큰 계열을 구성하며 많은 생물학적 과정을 조절하는 데 관여합니다1. GPCR은 세포외 측에서 작은 분자부터 큰 단백질까지 다양한 리간드를 감지합니다. 기능을 발휘하기 위해 GPCR은 연속적인 형태 상태를 샘플링하여 최대 활성 수준에서 활성 없음 수준을 생성합니다. 리간드는 수용체를 비활성 상태(역작용제의 경우) 또는 활성 상태(작용제의 경우)로 유지하는 뚜렷한 형태를 안정화합니다2. 리간드 결합 포켓에서 작용제에 의해 유도된 형태 변화는 수용체의 세포내 표면으로 전달되어 Gα 서브유닛에서 GDP를 GTP로 교환함으로써 이종삼량체 G 단백질을 활성화시킵니다. 결과적으로 Gα 및 Gβγ 하위 단위는 해리되어 다운스트림 신호 전달 과정을 활성화할 수 있습니다3,4. 광범위한 생리학적 관련성을 고려할 때 GPCR은 중요한 약물 표적이며1 GPCR 활성화로 이어지는 구조-기능 메커니즘을 이해하는 것은 향후 약물 개발에 매우 ​​중요합니다. 구조적 유연성은 적절한 수용체 기능에 필수적이지만 단백질 구조를 실험적으로 결정하는 데는 장애물입니다. 이는 GPCR을 구조 연구에 적용할 수 있도록 하기 위한 상당한 엔지니어링 노력의 동기가 되었습니다.

우리는 이전에 GPCR5,6,7,8의 생물물리학적 특성을 개선하기 위해 방향성 진화를 사용하는 여러 전략을 고안했습니다. 방향진화(Directed Evolution)는 반복적인 유전자 다양화와 선택을 통해 자연적 진화 과정, 즉 유전적 변이체 풀에 암호화된 바람직한 형질의 강화를 가속화하는 것을 목표로 합니다. 따라서 단백질 기능은 새로 변경되거나 생성될 수 있으므로 방향성 진화는 새로운 분자 도구 및 치료법을 개발하는 강력한 방법이 되었지만 대부분 수용성 단백질에 적용됩니다. 이 방법론을 GPCR로 확장하기 위해 박테리아 및 효모와 같은 미생물 유기체가 사용되었습니다. 플라스미드로 형질전환하면 평균적으로 하나의 복사본을 차지할 수 있으므로 플라스미드가 복사본 수를 설정한 후에도 각 미생물 세포는 여전히 "클론" 상태입니다. 효모의 원형질막이나 E. coli의 내막에서 기능적 형태의 GPCR 발현이 확인되었으며5,8,9 따라서 표현형과 유전자형의 엄격한 결합이 보장되며 이는 방향성 진화의 핵심 요구 사항입니다. 더욱이, 다양한 유전자 라이브러리를 효율적으로 나타내기 위해 미생물에서 높은 형질전환율을 달성할 수 있습니다. 리간드 결합 수와 막 내 기능적 수용체의 수에 따른 선택을 사용하여 구조 연구 및 약물 발견 프로젝트10,11,12,13,14,15에 중요한 역할을 하는 잘 발현되고 안정적인 다양한 GPCR 변이체가 생성되었습니다. 16,17.