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Aug 06, 2023

딥러닝을 활용한 루시퍼라제의 새로운 설계

자연 614권, 페이지

Nature 614권, 774~780페이지(2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

새로운 효소 디자인은 기하학적으로 호환되는 기본 지지체1,2에 관심 있는 반응을 촉매할 것으로 예상되는 활성 부위와 기질 결합 포켓을 도입하려고 시도했지만 적합한 단백질 구조가 부족하고 기본 단백질 서열의 복잡성으로 인해 제한되었습니다. – 구조 관계. 여기에서는 다양한 주머니 모양과 이를 인코딩하는 설계된 서열을 포함하는 이상화된 단백질 구조를 다수 생성하는 딥 러닝 기반 '가족 전반에 걸친 환각' 접근 방식을 설명합니다. 우리는 이러한 지지체를 사용하여 합성 루시페린 기질인 diphenylterazine3 및 2-deoxycoelenterazine의 산화 화학발광을 선택적으로 촉매하는 인공 루시퍼라제를 설계합니다. 설계된 활성 부위는 모양 상보성이 높은 결합 포켓에서 반응 중에 발생하는 음이온에 인접한 아르기닌 구아니디늄 그룹을 배치합니다. 두 루시페린 기질 모두에 대해 우리는 높은 선택성을 가진 설계된 루시퍼라제를 얻습니다. 이들 중 가장 활성이 높은 것은 작고(13.9 kDa) 열에 안정한(녹는 온도가 95°C보다 높은) 효소로, 디페닐테라진에 대한 촉매 효율(kcat/Km = 106 M−1 s−1)은 다음과 비슷합니다. 천연 루시퍼라제이지만 기질 특이성이 훨씬 더 높습니다. 생물의학 분야에 광범위하게 적용되는 매우 활성적이고 특이적인 생물촉매를 처음부터 생성하는 것은 전산 효소 설계의 핵심 이정표이며, 우리의 접근 방식은 광범위한 루시페라제 및 기타 효소의 생성을 가능하게 해야 합니다.

루시페라제에 의한 루시페린 기질의 효소적 산화에 의해 생성된 생물발광 빛은 생물의학 연구에서 생물검정 및 영상화에 널리 사용됩니다. 여기 광원이 필요하지 않기 때문에 어둠 속에서 발광 광자가 생성됩니다. 이는 살아있는 동물 모델과 자가형광 또는 광독성이 우려되는 생물학적 샘플에서 형광 이미징보다 더 높은 감도를 제공합니다4,5. 그러나 분자 프로브로서 루시퍼라제의 개발은 여러 가지 이유로 잘 발달된 형광 단백질 툴킷의 개발보다 뒤떨어져 있습니다: (i) 원시 루시퍼라제가 확인된 경우가 거의 없습니다6,7; (ii) 확인된 것 중 다수는 구조를 안정화하기 위해 다중 이황화 결합을 필요로 하므로 포유동물 세포에서 잘못 접히는 경향이 있습니다8; (iii) 대부분의 천연 루시페라제는 더 바람직한 광물리적 특성을 지닌 합성 루시페린을 인식하지 못합니다9; (iv) 상호 직교하는 루시퍼라제-루시페린 쌍을 사용하여 여러 프로세스를 병렬로 수행하기 위한 다중화 이미징은 기본 루시퍼라제10,11의 낮은 기질 특이성으로 인해 제한되었습니다.

우리는 de novo 단백질 디자인을 사용하여 작고 매우 안정적이며 세포에서 잘 발현되고 하나의 기질에 특이적이고 보조 인자가 필요하지 않은 루시퍼라제를 만들기 위해 노력했습니다. 우리는 높은 양자 수율, 적색 편이 방출3, 유리한 생체 내 약동학12,13 및 발광에 필요한 보조 인자가 부족하기 때문에 합성 루시페린인 디페닐테라진(DTZ)을 표적 기질로 선택했습니다. 이전의 컴퓨터 효소 설계 노력은 주로 단백질 데이터 뱅크(PDB)1,2에서 기본 단백질 골격의 용도를 변경했지만 DTZ에 적합한 결합 포켓이 있는 기본 구조는 거의 없으며 기본 단백질에 대한 서열 변화의 효과는 예측할 수 없습니다(설계됨) 나선형 다발은 효소 지지체로도 사용되었지만 숫자가 제한되어 있으며 대부분 DTZ 결합에 적합한 포켓이 없습니다. 이러한 한계를 회피하기 위해 우리는 DTZ에 적합한 크기와 모양의 포켓을 갖고 후속 활성 사이트 통합을 용이하게 하기 위해 명확한 서열-구조 관계를 갖춘 작고 안정적인 단백질 지지체를 다수 생성하기 시작했습니다. 이러한 포켓을 호스팅할 수 있는 단백질 접힘을 확인하기 위해 먼저 DTZ를 4,000개의 기본 소분자 결합 단백질에 도킹했습니다. 우리는 많은 NTF2 (nuclear Transport Factor 2)와 유사한 접힘이 DTZ 배치에 적합한 모양 상보성과 크기를 갖는 결합 포켓을 가지고 있음을 발견했으며 (그림 1e의 분홍색 대시) 따라서 NTF2와 유사한 슈퍼 패밀리를 대상 토폴로지로 선택했습니다.